Nacque a Firenze il 18 agosto 1835, figlio di Giovanni, un pittore della corte del Granduca. Dopo aver frequentato i corsi di disegno dal nudo all'Accademia di Belle Arti fiorentina, e dopo aver dipinto dal vero con Odoardo Borrani e Vincenzo Cabianca, inizia a frequentare il caffè Michelangelo. Nel 1858 si recò a La Spezia alla ricerca di un ambiente visivo che gli rendesse più facile, nel diretto rapporto con il "vero", la definizione di quel netto contrasto tra luce ed ombre capace di individuare la macchia come elemento grammaticale dell'opera. Nel 1859 partecipa agli eventi militari e parte per il fronte, al ritorno dalla guerra, nel 1860, sperimenta con Cabianca un metodo scientificamente analitico per la resa pittorica dei valori cromatici e luminosi, dipingendo dal vero nella campagna di Montelupo e a La Spezia e ritornando sui luoghi delle battaglie dell'anno precedente.
Nel 1861 a Parigi, conosce personalmente l'anziano Corot e si interessa alla pittura di paesaggio. Nello stesso anno ed è l'unica volta è a Castiglioncello con Martelli Abbati e Tedesco, in occasione della prima visita alla tenuta. Nel 1862 si consolidò l’amicizia con Silvestro Lega, insieme al quale dipinse a Piagentina. Nel 1865 si impegna con energia anche nel tema sociale, col dipinto famoso del "Salone delle agitate in S. Bonifazio", ambientato in un manicomio di Firenze. Nel 1867 fonda con il critico Diego Martelli "Il Gazzettino delle Arti e del Disegno" e vi collabora attivamente. Nel 1871 si reca a Roma e a Napoli con Adriano Cecioni e Giuseppe De Nittis. Signorini soggiorna più volte a Parigi e a Londra a partire dal 1873. Muore a Firenze il 10 febbraio 1901.